К содержанию

Вернуться к номерам журналов

<<< Предыдущая  Следующая>>>

ПОЛИМОРФный маркер 4G(-675)5G гена ингибитора активатора плазминогена 1 типа и система гемостаза у больных ишемической болезнью сердца

Затейщиков Д.А., Селезнева Н.Д., Минушкина Л.О., Кудряшова О.Ю., Серегин Ю.В.*, Носиков В.В.*, Баринов В.Г., Цимбалова Т.Е., Сидоренко Б.А.

Медицинский центр УД Президента РФ

Государственный научный центр «ГосНИИ генетика»

Plasminogen inhibitor activator gene 4G(-675)5G polymorphism and hemostasis in patients with ischemic heart disease

Zateyshchikov D.A., Selesneva N.D., Minouchkina L.O., Kudryashova O.Yu., Seregin Yu.V., Nosikov V.V., Barinov V.G., Cimbalova T.E., Sidorenko B.A.

The aim of the study was to investigate plasmonogen activator inhibitor gene (PAI-1) 4G(-675)5G polymorphism alleles and genotypes frequency in patients with ischemic heart disease and patients with risk factors and association between this polymorphism and main hemostasis parameters. We enrolled 84 patients with ischemic heart disease hospitalized into 51 Clinical City Hospital with unstable angina. Control group was consist of 85 patients with atherosclerosis risk factors and without symptoms of coronary artery disease. Plasma activities of plasminogen activator inhibitor, protein C, antithrombin, plasminogen and a2-antiplasmin were measured in venous occlusion test. PAI-1 gene 4G(-675)5G polymorphism was determinate by polymerize chain reaction with restriction fragment length analysis.

 There were  no significant differences in allele and genotypes frequencies of the PAI-1 gene between control and study groups. Hemostasis parameters were compared in patients with ischemic heart disease and different PAI-1 gene genotypes. There were no significant correlation between PAI-1 plasma activity and PAI-1 genotypes. The level of a protein C also did not differ - 4G/4G - 115,8±4,35 %; 4G/5G - 120,0±2,98 %; 5G/5G - 129,4±5,81%. After venous occlusion test in patients with a 4G/4G genotype the ejection of a protein С: 2,51±3,814 % was observed. The patients with a 5G/5G genotype had the consumption of a protein С: -6,23±2,344 %. And in the patients with a 4G/5G genotype the weak consumption of protein C was observed : -0,67±1,618 % (р=0,027). To a genotype 4G/4G there corresponded most low level of plasminogen, whereas the maximal level of this factor was characteristic for carriers of a genotype 5G/5G (р=0,010): 4G/4G - 104,3±2,86 %; 4G/5G - 106,5±1,86 %; 5G/5G - 117,7±4,30 %.

Thus, allele 4G of a gene PAI-1 in a genotype of the patients CAD associate with violations in a system of a thrombomoduline-protein С

Повышенный уровень ингибитора активатора плазминогена I типа (PAI-1) ассоциируется с более тяжелым течением ишемической болезни сердца. Механизм такого повышения до настоящего времени не ясен. Одна из возможных гипотез, объясняющих это состояние – его генетическая предрасположенность. Известно, что уровень транскрипции mРНК гена PAI-1 коррелирует с определенным аллельным вариантом этого гена. Именно это и позволяет считать ген PAI-1 одним из возможных генов кандидатов, определяющих наследственную предрасположенность к ИБС.

Описан ряд полиморфных маркеров гена PAI-1. Наиболее часто в исследованиях используется мононуклеотидный полиморфный маркер типа делеция/вставка, расположенный в промотерной области в положении –675 (4G(-675)5G). У носителей аллеля 4G как в гетеро- так и в гомозиготном состоянии отмечается и более высокий уровень PAI-1 плазмы [1] и больший риск развития острых коронарных синдромов [2].

Целью нашего исследования было изучение распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PAI-1 среди больных ИБС и у пациентов с факторами риска ИБС и оценка  возможной связи аллелей этого гена с основными параметрами эндотелиального и плазменного гемостаза.

Материал и методы

Обследовано 84 больных с ишемической болезнью сердца больных: 52 мужчины и 32 женщины, госпитализированных по поводу развития нестабильной стенокардии в стационар 51 Городской клинической больницы г.Москвы. Средний возраст больных составил 61,5±1,16 года, артериальной гипертонией страдали 75 (89,3%) пациентов, курили  30 больных (35,7%). Крупноочаговый инфаркт миокарда в анамнезе имел 31 пациент (36,9%). Гиперхолестеринемией (уровень общего холестерина сыворотки крови выше 5,2 ммоль/л) страдали 62 пациента (73,8%), избыточную массу тела (индекс Кетле больше 25 кг/м²) уровень общего холестерина в среднем по группе составил 5,9±0,12 ммоль/л; индекс Кетле – 27,4±0,44 кг/м² имели 63 пациента (75%). Сахарным диабетом II типа страдали 8 больных (9,5%).  Все больные относились к белой расе, русской популяции и проживали в Москве.

Группа сравнения состояла из 85 пациентов, наблюдавшихся на кафедре кардиологии и общей терапии с факторами риска атеросклероза, но без клиники ИБС. В группе было 44 мужчины и 41 женщина, средний возраст – 51,3±1,21 года. Артериальной гипертонией страдали 79 пациентов (92,7%). Пациенты группы сравнения достоверно отличалась от группы пациентов с ИБС только по возрасту (р=0,0001).

Больные нестабильной стенокардией обследовались сразу после клинической стабилизации, на 3-7 день после отмены гепарина. К этому моменту больные не получали антикоагулянтной и антиагрегантной терапии за исключением аспирина, который назначался всем больным, не имеющим противопоказаний.

Взятие крови исходно и на фоне венозной окклюзии [3] проводили утром между 8 и 11 часами после 12-ти часового голодания.

В плазме крови измеряли  активность ингибитора тканевого активатора плазминогена, протеина С, антитромбина III, плазминогена, a2-антиплазмина. Измерение проводили на автоматическом анализаторе Behring Coagulation Timer. В связи с развивающейся во время веноокклюзивного теста гемоконцентрацией, при оценке факторов гемостаза после венозной окклюзии вводили поправочный коэффициент, равный отношению белка крови до к уровню белка после венозной окклюзии. Рассчитывали динамику изученных факторов гемостаза во время теста.

Генотипирование полиморфного маркера 4G(-675)5G  проводилось с помощью полимеразной цепной реакции с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов. Выделение ДНК из крови осуществлялось путем фенол-хлороформной экстракции.

Амплификация проводилась на термоциклере Терцик (ДНК-технология) в 50 мкл амплификационной смеси, содержащей 67 мM Трис-HCl (pH 8.8), 1 мМ хлорида магния, 16.6 mM  сульфата аммония, 0.1% твин-20, 0.2 mM каждого dNTP, 5 pmol каждого праймера, 100 нг геномной ДНК и 2.5 единицы Tаg-полимеразы. Проводилось 35 циклов ПЦР по следующей схеме : 94⁰C - 30 с, 64⁰C - 30 с, 72⁰C - 20 с

Использовались праймеры :

  PAI4G5G-F  5' - CACAGAGAGAGTCTGGCCACGT  - 3'   и

  PAI4G5G-R  5' - CCAACAGAGGACTCTTGGTCT     - 3'

В прямой праймер была внесена точечная замена по сравнению с последовательностью геномной ДНК для создания сайта узнавания рестриктазы BseLI.

В результате амплификации получали фрагменты ДНК длиной 98 или 99 пар нуклеотидов, которые затем инкубировали с рестриктазой BseLI. Фрагмент 99 п.н., амплифицируемый в случае вставки гуанина (аллель 5G), расщеплялся с образованием продуктов длиной 77 и 22 п.н., а фрагмент 98 п.н., амплифицируемый при делеции гуанина (аллель 4G), оставался нерасщепленным. Наличие продуктов с длинами 98 и 77 п.н., соответствующих аллелям 4G и 5G, определялось с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле с последующей окраской нитратом серебра.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью стандартного статистического пакета программ SPSS 8.02. Для протяженных переменных рассчитывали средние величины, их ошибки. При сравнении протяженных величин для оценки достоверности их различия использовали тест Kruskal-Wallis. Дискретные величины сравнивали методом Фишера и по критерию c². Для всех видов анализа статистически значимыми считали значения p<0,05.

Результаты

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PAI-1 в группах больных ИБС и у пациентов из группы сравнения представлены в таблице 1. Легко видеть, что различия в частотах  статистически недостоверны.

Таблица 1

Частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PAI-1 в группах больных ИБС и у здоровых лиц  с факторами риска атеросклероза

Распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. В связи с этим было проведено сравнение основных клинических параметров и факторов риска атеросклероза у больных с разными генотипами полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PAI-1 в группе пациентов с ИБС. Результаты сравнения представлены в таблице 2. Как видно из этой таблицы, достоверных различий в клинической характеристике  между больными с разными генотипами выявлено не было.

Таблица 2

Основные клинические характеристики пациентов с разными генотипами полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PAI-1

¹Сравнение проведено тестом Kruskal-Wallis

²Сравнение проведено с использованием критерия c²

Исследование параметров системы гемостаза проводилось только у пациентов с ишемической болезнью сердца. В таблице 3 представлено сравнение основных параметров гемостаза как исходно, так и на фоне венозной окклюзии у пациентов с разными генотипами PAI-1.

Таблица 3

Основные параметры системы гемостаза у пациентов с различными генотипами полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PAI-1

Сравнение проведено тестом Kruskal-Wallis

Таким образом, в обследованной нами группе больных достоверных различий в активности плазменного PAI-1 обнаружено не было, однако пациенты, имеющие в генотипе аллель 4G, отличались несколько более высоким уровнем активности PAI-1.  Не отличалась и динамика PAI-1 после венозной окклюзии. Однако, нами была выявлена статистически достоверная корреляция между изменением концентрации протеина С при ВОТ и генотипом маркера 4G(-675)5G (табл.3). Исходный уровень протеина С у больных из всех трех групп практически не различался, однако на фоне окклюзии у пациентов с генотипом 4G/4G наблюдался выброс протеина С (увеличение концентрации), в то время как у пациентов с генотипом 5G/5G наблюдалось повышенное потребление протеина С (уменьшение концентрации) (рис.1). У пациентов с генотипом 4G/5G наблюдалось промежуточное изменение концентрации протеина С при ВОТ (слабое потребление). Обнаружена достоверная корреляция генотипов маркера 4G(-675)5G с уровнем плазминогена. Генотипу 4G/4G соответствовал наиболее низкий уровень плазминогена, тогда как для носителей генотипа 5G/5G был характерен максимальный уровень этого фактора (различия достоверны – р=0,010).

Обсуждение результатов

В нашем исследовании в качестве полиморфного маркера гена PAI-1 рассматривается мононуклеотидная делеция/вставка в промотерной области гена (позиция 675 промотера). Аллели отличаются наличием четырех или пяти последовательных остатков гуанозина (5G/4G).

В 1995 году впервые была опубликована работа об ассоциации аллеля 4G гена PAI-1 с более высоким риском инфаркта миокарда у 100 молодых мужчин (35-45 лет) из шведской популяции [4]. Эти данные подтверждались рядом исследований, чаще всего на небольших группах больных [5,6]. В последующем был опубликован ряд разноречивых данных. Так, в достаточно крупном исследовании  1353 лиц , подвергшихся коронарографии в белой европейской популяции не было выявлено дополнительного риска ИБС связанного с полиморфизмом гена PAI-1 [7]. Не выявлено дополнительного риска развития ИМ, нестабильной стенокардии, ИБС, ОНМК по данным Фремингемского исследования (при обследовании 3177 лиц) [8].  В то же время метаанализ 9 исследований по принципу случай-контроль, проведенных в европейской популяции, показал более высокую частоту аллеля 4G в группе больных ИБС, причем максимальный риск наблюдался в группах лиц молодого возраста или при сочетании ИБС и сахарного диабета II типа [2]. Имеются интересные данные о более высокой частоте аллеля 4G гена PAI-1 у больных с ИБС, осложненной злокачественными желудочковыми аритмиями [9].

В исследованиях in vitro показано, что аллелю 4G соответствует более высокий уровень транскрипции гена [10, 4]. В ряде исследований было показано, что аллель 4G связан с более высокой активностью PAI-1, антигена PAI-1. Такие результаты в частности были получены при обследовании 228 ядерных семей европейской популяции (обследовались семьи, где оба родителя страдали ИБС и имелось по крайней мере двое детей) [11]. В исследовании рассматривалось три различных полиморфных маркера гена PAI-1, однако достоверная взаимосвязь была обнаружена только для маркера 4G(-675)5G. Более выраженной она оказалась у женщин. По данным Фремингемского исследования у здоровых родственников больных ИБС (n=1492) также обнаруживается ассоциация между аллелем 4G и более высоким уровнем антигена PAI-1. Однако вклад этого полиморфизма в определение уровня PAI-1 был меньше, чем других факторов: индекса массы тела, уровня триглицеридов, систолического артериального давления и курения. Употребление алкоголя, уровень общего холестерина и холестерина ЛНП, заместительная гормональная терапия и возраст оказывали меньшее влияние на уровень PAI-1 [12]. Связь аллеля 4G с более высоким уровнем активности PAI-1 была показана также в исследовании ECTIM у пациентов с инфарктом миокарда в возрасте моложе 45 лет [13] и у пациентов с инсулин независимым сахарным диабетом [14].

В нашем исследовании, хотя пациенты гомозиготные по аллелю 4G и имели несколько более высокий уровень активности PAI-1, однако эти различия оказались недостоверными. Не выявлено и каких либо достоверных различий в динамике PAI-1 после венозной окклюзии. Вероятнее всего это связано с небольшим количеством обследованных больных. 

Наиболее интересными представляются различия в динамике протеина С при венозной окклюзии у пациентов с разными генотипами гена PAI-1. Динамика протеина С, как было показано ранее, может свидетельствовать о потенциальных антикоагулянтных возможностях системы тромбомодулина. Оказалось, что во время венозной окклюзии генерация тромбина может приводить к потреблению протеина С (в этом случае не увеличивается уровень фибринопептида А, то есть тромбин успешно утилизируется тромбомодулином). В случае, когда уровень протеина С возрастает, также увеличивается концентрация фибринопептида А, т.е. система тромбомодулина не справляется с тромбином и происходит активация свертывания. В последнем случае можно говорить об эндотелиальной дисфункции. Т.е. по динамике протеина С во время венозной окклюзии можно определить степень эндотелиальной антикоагулянтной защиты ТМ [15]. Также показано, что «выброс» протеина С при венозной окклюзии является одним из факторов, определяющих неблагоприятный прогноз у больных ИБС [16]. В данной работе было выявлено, что аллель 4G гена PAI-1 ассоциирован с «выбросом» протеина С при ВОТ, что может говорить о наличии у этих больных нарушенной антикоагулянтной функции эндотелия.  

Более низкий уровень плазминогена у больных с 4G/4G генотипом может свидетельствовать о большем его потреблении и, косвенно, соответствует данным о более высоком уровне ТАП у таких больных, полученным M.Henry [11].

Таким образом, аллель 4G гена PAI-1 в генотипе больных ИБС ассоциирован с эндотелиальной дисфункцией.

Литература

1.      N.Iwai, H.Shimoike, Y.Nakamura et al. The 4G/5G polymorphism of the plasminogen activator inhibitor gene is associated with the time course of progression to acute coronary syndromes// Atherosclerosis.-1998.-V.136.-№1.-P.109-114.

2.      L. Iacoviello, F. Burzotta, A. Di Castelnuovo et al The 4G/5G polymorphism of PAI-1 promoter gene as a risk factor for myocardial infarction: a meta-analysis.  Tromb Hemost 1998; V80:P1029-1030

3.      Д.А.Затейщиков, А.Б.Добровольский, О.В. Аверков, А.Н.Сторожилова, Е.П.Панченко, Дж.Боннет, Н.А. Грацианский. Изучение антикоагулянтных свойств эндотелия с помощью стандартного веноокклюзивного теста. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1992, N12, C.605-608.

4.      P. Erriksson, B.Kallin, FM van”t Hooft et al. Allele-specific increase in basal transcription of plasminogen-activator inhibitor 1 gene is associate with myocardial infarction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995; V 92: P1851-1855 

5.      N.Ossei-Gerning, MW Manfield, MH Stikland et al. Plasmonogen activator inhibitor-1 promoter 4G/5G genotype and plasma levels in relation to a history of myocardial infarction in patients characterized by coronary angiography. Atherosclerosis, Thrombosis and vascular Biology 1997; V17:P33-37

6.      J.Mikkelsson, M Perola, U. Wartiovaara et al. Plasminogen activator Inhibitor-1 (PAI-1) polymorphism, Coronary Thrombosis, and Myocardial Infarction in Middle-aged Finnish Men who died suddenly. Tromb Hemost 2000;V84:P78-82

7.      J.B. Muhlestein, J.Habashi, J.F. Carlquist et al. Polymorphism of the Plasminogen Activator Inhibitor-1 Gene is not Associated with an Increased Risk of Coronary Artery Disease or Myocardial Infarction in a Caucasian Population. 48^th Annual Scientific Session of ACC, 1999, New Orlean, USA. Abst. 1106

8.      DL Feng, G.H. Tofler, M.G. Larson et al.The Plasminogen Activator Inhibitor-1 Gene 4G/5G Polymorphism and Cardiovascular Disease: The Framingham Heart Study. 48^th Annual Scientific Session of ACC, 1999, New Orlean, USA. Abst. 1191

A.Anvari, Z. Turel, E.Schuster et al. PAI-I Gene Polymorphism in Patients With Coronary Artery Disease and Malignant Ventricular Arrhythmias. 48^th Annual Scientific Session of ACC, 1999, New Orlean, USA. Abst. 1204

К содержанию

Вернуться к номерам журналов